应欧洲法规管理学会（European Compliance Association，ECA）邀请，经国家药品监督管理局批准，谭德讲副主任、贺庆研究员于2024年6月25日至2024年6月29日赴德国慕尼黑参加2024欧洲微生物大会（European Microbiology Conference，EMC）。
一、会议背景
欧洲微生物大会是由欧洲法规管理学会组织举办的年度学术会议。受邀人员包括药品监管机构[如世界卫生组织（WHO）、欧洲药品监管局（EMA/EDQM）、美国药典（USP）]、学术研究机构和国际知名药企[如诺华制药（Novartis）、赛诺菲（Sanofi）]等机构的专家，主要围绕药品的微生物污染控制、药品质控方法的验证、热原和内毒素检测等领域进行报告与交流讨论，旨在促进药品监管部门、药品研发与生产企业对药品微生物污染的科学监管。
二、会议内容
本次会议的重点内容包括：①从替代方法和现代方法角度介绍药典最新发展；②污染控制方法—监测、消毒等；③方法验证和结果解释；④监测—温度及其他挑战；⑤美国药典、欧洲药典和中国药典的内毒素/热原检测要求和进展；⑥生物指示物。我院贺庆研究员受邀在本次会议进行题为“中国药典热原/内毒素检测方法的最新进展（Latest Progress of Pyrogen/Endotoxin Test in Chinese Pharmacopoeia）”的会议报告。本次会议报告主要内容如下：
Dr. David Roesti（Novartis）介绍USP快速微生物检测方法（rapid microbiological methods，RMM）小组委员会及其未来工作计划：RMM小组委员会在USP微生物专家委员会组织框架内开展工作，强调传统微生物检测方法不适用于有效期短、供应有限、需求迫切的产品[如先进疗法（细胞和基因治疗）、复合无菌制剂、正电子发射断层扫描产品]，RMM可提供针对传统药典方法的替代方案，可减少测试时间、减少样品使用量、实现自动化、提高灵敏度和准确性。RMM小组委员会拟开展工作涉及的主要章节包括：<1071>针对无菌短保质期产品放行的快速微生物检测法—基于风险的方法，<72>针对短保质期产品中污染的基于呼吸的快速微生物检测方法，<73>针对短保质期产品中污染的基于ATP生物发光的快速微生物检测方法，<74>针对短保质期产品中污染的基于固相细胞术的微生物检测方法，<75>短保质期产品中污染的检测方法，<60>洋葱伯克氏菌复合体非无菌产品的微生物学检验和<65>洋葱伯克氏菌复合体核酸扩增试验。
Dr. Michel Miller（Microbiology Consultants LLC）介绍美国非肠道用药协会（parenteral drug association，PDA）技术报告33（TR33）的拟修订工作—微生物检测替代方法的评价、验证和实施：强调其主要目的是平衡监管要求、科学原则与替代方法验证的实际手段之间的关系，同时确保替代方法的实验设计、数据分析和验收标准能适用于方法的预期用途。替代方法验证需要供应商进行初步验证，使用人员进行方法适用性（样品兼容性）验证、选择性地进行预期用途验证、还需进行替代方法和已有方法的可比性验证（如非劣性统计方法）。为促进快速微生物检测替代方法的执行，EDQM下一步将探索建立针对快速微生物检测方法评价和验证的集中认证体系的可行性。
Dr. Jeanne Moldenhauer（Excellent Pharma Consulting）介绍物理方法控制污染的应用：病毒、微生物和朊病毒一般都带负电荷；当正负电荷颗粒间的吸引力足够大时，其可裂解微生物的膜或壁，分解微生物，病毒或朊病毒的蛋白质结构，最终破环这些微生物。物理灭活方法广泛应用于杀菌剂（如水合氢离子的使用、消毒剂中带正电银离子的使用）、纺织品（如擦拭巾、个人防护服）、滤器、紫外线杀菌照射、静电除尘器、臭氧发生器、热力学灭菌。采用物理灭活方法的新技术有助于改善作业中的污染控制，具体方法的选择需要权衡利弊。
Dr. Miriam Guest（Charles River Laboratories）介绍类型培养菌株的分类、命名和系谱：强调大多数药典所列的微生物都不是类型菌株（type straspan）,非类型菌株更有可能受到命名变化的影响；当微生物实验室QC验证培养收集生物时，使用经过验证的ID系统可能会影响报告的结果；USP <1117>要求使用的培养菌株应来自国家培养菌株保藏库或合格的二级供应商（如与ATCC菌株的文件等效性、使用前确认纯度和特性）；应对实验室所使用材料的可用性有预期的区域差异。
Dr. Laurent Leblanc（bioMérieux）介绍实现单温孵育的挑战和解决方案：目前各国药典对微生物环境监测样本（EM）孵育温度和时间均只描述其大致范围。PDA单一培养基/单一温度研究小组开展的体外研究表明单一温度方案（25~30℃）的性能与低/高和高/低温度方案一样好。bioMérieux 开展的体外实验表明27.5℃对枝孢子菌（Cladosporium spp）的检测会产生较大影响（回收率为8%），对绝大多数微生物的检测均不会有影响（回收率为50%~200%），采用单一孵育温度是可能的；25℃是检测所有微生物的一个合适温度，其可能会减少检测时间（time to results，TTR）；27.5℃也被认为可以改善TTR，但该温度可能难以检测到某些霉菌。
Dr. Marsha Steed（Member USP Microbiology Expert Group）介绍USP微生物专家委员会和微生物总论的最新进展：USP微生物专家委员会（microbiology expert committee，MEC）下设分委会的专业领域包括内毒素和热原、快速微生物检测法、无菌保证和微生物控制、生物负荷与污染、膳食补充剂和食品配料中的微生物问题。微生物相关通则的更新进展，涉及章节包括<72>、<73>、<1071>、<74>、<77>支原体核酸扩增试验、<1119>生物负荷监测、<1119.1>生物负荷试验、<1114>细胞和基因治疗产品的微生物控制策略、<1116>无菌加工环境微生物控制与监测。
内毒素和热原相关通则的最新进展包括<86>采用重组试剂[包括重组C因子（rFC）、重组鲎试剂（rCR）]进行的细菌内毒素检测法，四种内毒素检测试剂测定四种具有代表性的非肠道用产品中内毒素水平的比较研究。MEC已接受<86>在药典论坛（pharmacopeial forum，PF）49（6）中发表的建议，其方法包括rFC终点荧光检测法和rCR动态显色法。<86>目前为草案，USP尚未建立其各论（momograph），也未将其列入总论（general notices）中，在此之前，USP会将<86>作为一种替代方法并应满足总论6.30中的相应要求，使用者应评估试剂供应商的验证材料（primary validation package）并进行适用性验证（suitability tests），同时证明<86>作为替代方法的等效性。重组试剂的使用被认为是未来内毒素检测的金标准。工业用水的内毒素检测是内毒素检测法的重要应用领域。
Dr. Qing He（NIFDC）介绍中国药典热原/内毒素检测方法的最新进展：热原/内毒素检测是评价各类药品安全性的关键指标。传统体内家兔热原检查法因方法变异大、成本高、不符合国际3R原则，即将被淘汰；而传统体外鲎试剂内毒素检查法面临鲎资源日趋濒危、鲎试剂供应短缺和无法检测非内毒素热原的国际问题； WHO、EMEA和FDA等国际监管机构正倡导各国国家质控实验室开展动物替代技术研究。
目前2020版中国药典收录的热原/内毒素检查法包括家兔热原检查法（11142）、鲎试剂（1143）和重组C因子（9251）细菌内毒素检查法、单核细胞活化法（9301）和报告基因热原检查法（3309）。报告基因热原检查法是NIFDC最新针对现有单核细胞活化法所用人血来源不便、难于标准化和推广普及的国际难题，利用炎症反应中枢信号分子NF-κB作为热原标志物，结合报告基因技术，原创性建立并验证的转基因细胞系热原检测替代方法（Signal Transduct Target Ther.2024;9(1):33.）及其国家药典标准[《中国药典》2020版第一增补本（新增通则和指导原则）：3309 体外热原检查法(报告基因法)]，该方法可为药品热原/内毒素检测提供全新的替代方案。未来我们将继续提高热原/内毒素检测动物替代新方法和新标准的研究，推进该领域朝3R方向进一步发展。
Dr Bernhard Illes（Microcoat）报告容器类型和材料对内毒素和葡聚糖回收的影响：随存放时间延长，玻璃和共聚聚脂（polyethylene terephthalate glycol，PETG）容器水中的内毒素回收率未有显著变化，而聚丙烯和聚碳酸酯容器水中的内毒素回收率出现显著下降。表明即使在没有配方或原料药的水溶液中，材料也会影响内毒素回收率；吸附作用和水溶性成分为可能原因；容器的影响可能因制造商/批次而异（如聚丙烯容器的差异）；样品处理的效果可能因容器而异；应尽早将原始包装容器纳入方法开发中。复合容器具有较强影响内毒素回收的潜力，在方法开发中尽早包含原始容器；理想的方法应适用于各条件下的样品，可选择在原容器中直接处理样品，或优化样品转移和所需方法；强调开发的方法必须适合于放行检测。容器效应不仅对内毒素有影响，而且对1-3-葡聚糖的回收也有影响；容器效应的强度可能取决于温度[冻结/解冻；室温（RT） vs - 20℃]；低回收率通常是由不同因素共同造成的。
三、会议总结
为满足创新产品的发展需求，更为快速简便、科学准确的替代方法和技术研究正日益得到国际药品监管机构和药品研发机构的重视且发展迅速。针对快速微生物检测方法的发展需求，USP、PDA和EDQM正积极修订和建立相应的标准体系[包括<60>、<65>、<72>、<73>、<74>、<75>、<77>、<86>、<1071>、<1114>、<1116>、<1117>、<1119>、TR33]，相关机构也在积极开发和推广相应技术（如蛋白A色谱树脂污染的修复技术、物理方法控制污染技术、制药级水系统的污染控制技术、环境消毒技术、微生物环境监测样本快速检测技术、流式细胞术在线监测生物负荷技术、内毒素/热原检测动物替代技术、生物指示物技术）。我国针对上述发展趋势和需求，也积极建立了相应的内毒素/热原检测技术标准体系[包括（1142）、（1143）、（9251）、（9301）、（3309）]，同时现有标准体系还具有较大的提升空间。
综上，我们应关注国际药品监管科学研究领域的发展趋势和创新药品产业的发展需求，重点布局相关新标准、新技术、新方法的研究以及我国药品监管科学的国际化发展战略，注重创新，通过积极参加此类国际学术会议展示相关研究成果，提升我国药品监管科学的研究水平和国际影响力，更加深度参与国际药品监管科学研究。
（贺庆）
