照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱柱:岛津 C18-AQ HSS(2.1×150mm;1.9µm);流动相:以乙腈为流动相A,0.5%醋酸溶液为流动相B,按表5-5进行梯度洗脱;检测波长:350nm;流速:0.3ml/min;进样量:1µl、2µl;柱温:30℃。理论板数按杨梅苷峰计,应不低于5000,杨梅苷峰与相邻峰之间的分离度应符合要求。
表5-5 梯度洗脱表
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~10 | 75→74.5 | 25→25.5 |
10~11 | 74.5→90 | 25.5→10 |
11~15 | 90 | 10 |
对照品溶液(参比溶液):精密称取杨梅苷对照品11.00mg,置100ml量瓶中,加甲醇至刻线,摇匀,作为储备液。再精密量取杨梅苷对照品储备液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻线,摇匀,作为对照品溶液。再将杨梅苷对照品储备液逐级稀释,配制成14.1μg/ml 杨梅苷参比溶液。
供试品溶液:取本品适量,研细,取约1.5g(相当于醋五灵脂药材0.2g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20ml,超声(500W,40kHz)1小时,放冷,滤过,作为供试品溶液。
对照药材溶液:取五灵脂对照药材0.2g,同供试品溶液制备方法制成五灵脂对照药材溶液。
本品中检出人造五灵脂以杨梅苷计不得过14.1μg/ml。
液质联用法
色谱方法:岛津 C18-AQ HSS (2.1×150mm;1.9µm);流动相:以乙腈为流动相A,0.5%醋酸溶液为流动相B,按表5-7进行梯度洗脱;流速为0.3 ml/min;供试品与对照进样量均为1µl;柱温:30℃。
表5-7 梯度洗脱表
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~5 | 25→30 | 75→70 |
3~6 | 30→90 | 70→10 |
质谱方法:采用质谱检测器,离子源:电喷雾离子源(electronic spray ionization,ESI),正离子扫描,多反应监测模式(MRM);利用保留时间和离子丰度判断定性结果,利用峰面积半定量;Curtain Gas:35.0;Collision Gas:中等;IonSpray Voltage:5500.0;Temperature:550,质谱参数见表5-8。
表5-8 质谱参数表
成分 | 相对分子质量 | 时间 min | 母离子m/z | 子离子m/z | 碰撞能量 eV | 模式 |
杨梅苷 | 464.386 | 3.8~3.9 | 319.0 | 195.0 125.0 108.0 | 26/15/15 | + |
参比溶液:取HPLC研究项下储备液,加基质溶液最终稀释成14.1μg/ml 杨梅苷对照品溶液(相当于四消丸中掺伪10%人造五灵脂样品溶液的面积均值)。
供试品溶液:同HPLC项下供试品溶液。
本品中检出人造五灵脂以杨梅苷计不得过14.1μg/ml。