液相色谱串联质谱法

色谱条件及系统适用性    色谱柱为Waters Coetecs T3 （2.1×100 mm，2.7 μm），流动相A为0.1%甲酸-0.5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B乙腈，柱温为40℃，流速为0.2 ml/min，进样量为5 μl，梯度洗脱，洗脱程序表1。

表1  梯度洗脱程序

质谱条件：质谱检测器：ESI源（ 正/负  电离模式）；扫描方式：MRM多反应离子监测；离子化电压：5500/-4500V；脱溶剂气温度：550˚C；气帘气压力：35psi；辅助加热气压力55psi；雾化气压力：55psi。质谱条件见表2。

表2  大环内酯类、氯霉素、磺胺类和喹诺酮类药物定性定量离子对

对照品溶液的制备    分别准确量取混合标准中间液1：0.25mL；混合标准中间液2：1.25mL；混合标准中间液3：2.5mL；混合标准中间液4：2.5mL；置于同一50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到混合标准工作液。其中土霉素、四环素、金霉素、多西环素、甲氧苄啶、氟苯尼考胺的浓度均为0.5μg/mL；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的浓度均为250ng/mL；恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、替米考星、林可霉素、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺噻唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、地美硝唑的浓度均为50ng/mL；磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲硝唑的浓度均为25ng/mL；氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的浓度均为5.0ng/mL。

供试品溶液的制备    蛇毒类样品的制备：精密称取蝰蛇毒、尖吻蝮蛇蛇毒各50mg，加入高纯水1ml溶解，再加入1ml（1%甲酸乙腈）提取，超声30min，加入0.2g氯化钠，10000rpm离心5min，取上层液体备用；蛇毒血凝酶注射液样品的制备：精密量取蛇毒血凝酶注射液1ml，加入1ml（1%甲酸乙腈）提取，超声30min，加入0.2g氯化钠，10000rpm离心5min，取上层液体备用。

测定法    精密量取空白、系列混合对照品溶液及供试品溶液各5 μl，进样分析，以系列混合对照品溶液的浓度（ng/ml）为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，相关系数（r）应大于0.99。供试品中不得检出大环内酯类、氯霉素、磺胺类和喹诺酮类药物。

定量限  土霉素、四环素、金霉素、多西环素、甲氧苄啶、氟苯尼考胺为200ng/g；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的浓度均为100ng/g；恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、替米考星、林可霉素、地美硝唑均为20ng/g；磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺噻唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲硝唑均为10ng/g；氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素均为2ng/g。