1.1有关物质

照高效液相色谱法（中国药典2020年版四部通则0512）测定。

离心管和梨形瓶的预处理用甲醇润洗玻璃离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干。

固相萃取柱的活化每一份样品使用一个固相萃取柱，固相萃取柱先用乙腈润洗两次，每次5ml，再用正己烷-乙酸乙酯（10:1）的混合溶液冲洗两次，每次5ml。

供试品溶液取本品约1.0g，精密称定，置10ml具塞玻璃离心管中，加入正己烷-乙酸乙酯（10:1）5ml，涡旋振荡至软膏完全混悬，以每分钟3000转的速度离心5分钟，取上清液，重复上述过程，将两次提取得到的上清液全部转移至已活化好的以硅胶为吸附剂的固相萃取柱中，用正己烷-乙酸乙酯（10:1）洗涤SPE柱6次，每次5ml，弃去洗涤液，再依次用乙酸乙酯5ml和乙腈5ml将吸附于柱上的分析物洗脱于50ml梨形瓶中，将洗脱液真空旋转蒸发至干（水浴温度小于40℃），精密加入稀释剂[正己烷-正丁基氯-乙腈（1:1:1）]1ml，涡旋使残留物溶解。此溶液密封在室温条件下应在24小时内测定。

系统适用性溶液取他克莫司对照品与子囊霉素各约10mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。

色谱条件用羟丙基硅烷键合硅胶为填充剂（Supelcosil LC-Diol，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱），两根相同的色谱柱串联使用；以正己烷-正丁基氯-乙腈（70:20:10）为流动相（使用时温度在20℃以上）（配制说明：先将正丁基氯加入正己烷中，混匀，将流动相轻微加热至30℃，再加入乙腈，混匀至溶液澄清并脱气）；柱温为28℃；检测波长为225nm；进样体积20μl。

系统适用性要求取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液色谱图中，子囊霉素峰与他克莫司峰之间的分离度应不小于1.5，理论板数按他克莫司峰计算不得低于15000，拖尾因子按他克莫司峰计算应不大于1.5。

测定法精密量取稀释剂、空白辅料溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

限度供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除保留时间小于他克莫司峰保留时间0.6倍的色谱峰与空白辅料溶液中的色谱峰外，按加校正因子的峰面积归一化法计算，单个杂质峰面积乘以校正因子后应不得过下表杂质限度值要求。异构体Ⅰ与异构体Ⅱ不计为有关物质。

表.他克莫司软膏有关物质相关信息

1.2液滴粒度

取本品5～15mg置载玻片上，盖上盖玻片，采用金属圆柱体（质量约为320g，直径约为3厘米）按压约30秒，照粒度和粒度分布测定法（中国药典2020年版四部通则0982第一法）检查，在总放大倍数为400倍的显微镜下检视视野内的液滴分布情况，视野内液滴应分布均匀，液滴个数不少于300个，检测至少300个液滴，以投影面积计算等效直径，并以数量统计出D₅₀与D₉₅，D₅₀≤10μm，D₉₅≤21μm。

1.3锥入度

取本品适量，照锥入度测定法（中国药典2020年版四部通则0983），采用III号锥体及对应样品杯测定。将样品在70～80℃熔融，熔融后立即将样品小心装满样品杯，并使高出样品杯上沿约2mm，避免产生气泡，并在25±0.5℃放置24小时，刮平表面后测定。锥入度应为180～290。

1.4含量测定

照高效液相色谱法（中国药典2020年版四部通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Zorbax SB C8，4.6mm×75mm，3.5mm；或效能相当的色谱柱），以磷酸二氢钾溶液（磷酸二氢钾3.6g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5）-乙腈（50:50）为流动相A，以磷酸二氢钾溶液-乙腈（20:80）为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为60℃；流速为1.0ml/min；检测波长为210nm。对照品溶液记录的色谱图中，内标峰与异构体Ⅰ峰（相对保留时间约为0.49）的分离度应不小于1.5，异构体Ⅱ峰（相对保留时间约为0.73）与他克莫司峰的分离度应大于3.0，理论板数按他克莫司峰计算不低于2000，拖尾因子不大于1.5。

对照品溶液取他克莫司对照品适量，精密称定，加四氢呋喃溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的对照品贮备液，精密量取对照品贮备液10ml（0.1％软膏）或3ml（0.03％软膏），置100ml量瓶中，精密加入内标溶液10ml，再精密加入稀释剂[水-无水乙醇-四氢呋喃（2:1:5）] 80ml，用四氢呋喃稀释至刻度，混匀，室温静置4小时。

供试品溶液取本品1支内容物，混匀，取约1g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入四氢呋喃12ml，60℃水浴加热，轻摇至软膏溶解，加入水4.0ml，小心振摇至形成混悬液，置冰浴中冷却10分钟，放置至室温，加入无水乙醇2.0ml与内标溶液（取对羟基苯甲酸庚酯75mg，置1000ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀）2.0ml，剧烈振摇30秒，以孔径不大于0.5μm的滤膜过滤，取续滤液，室温静置4小时，作为供试品溶液。

测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按内标法以他克莫司峰、异构体Ⅰ峰和异构体Ⅱ峰峰面积之和计算供试品中他克莫司（C₄₄H₆₉NO₁₂）的含量。