【含量测定】总肽 照液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60%乙腈为流动相A,以0.14mol/L三水合乙酸钠溶液(用磷酸调节pH值至5.0)为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长为248nm;流速为每分钟1.0ml。
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~17 | 88.5 | 11.5 |
17~35 | 88.5→59 | 11.5→41 |
35~50 | 59→30 | 41→70 |
50~70 | 30 | 70 |
70~75 | 30→88.5 | 70→11.5 |
75~90 | 88.5 | 11.5 |
校正因子测定 取γ-氨基丁酸对照品适量,精密称定,加水制成每1ml含2mg的溶液,作为内标溶液A。精密量取内标溶液A 4ml,置250ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,作为内标溶液B。另取门冬氨酸对照品、谷氨酸对照品、脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、缬氨酸对照品、赖氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品、苯丙氨酸对照品、丝氨酸对照品、组氨酸对照品、精氨酸对照品、苏氨酸对照品适量,精密称定,加2mol/L盐酸溶液适量溶解,再加水制成每1ml含门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸各3mg,甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸各1.5mg,丝氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸各0.75mg的混合溶液,作为对照品溶液。精密量取对照品溶液2ml,置250ml量瓶中,精密加入内标溶液A 2ml,加水至刻度,摇匀,精密吸取10μl,精密加入硼酸盐缓冲液70μl,6-氨基喹啉-N-(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯(AQC)溶液20μl,马上涡旋混匀,55℃衍生11分钟,转移到衬管,精密吸取5~10μl,注入液相色谱仪,计算校正因子。
测定法 精密吸取本品20ml,通过已活化的C18小柱上(Waters Sep-Pak® Vac 6cc C18-1g),用水50ml洗脱,弃去洗脱液,再用75%甲醇100ml洗脱,收集洗脱液,水浴蒸干,残渣加水适量使溶解,并分次转移至10ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密吸取2ml至氨基酸水解管中,精密加入水1ml和盐酸2ml,混匀,在110℃水解24小时,取出,放冷,转移至蒸发皿中,用少量水洗涤氨基酸水解管,洗液并入蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加水适量使溶解,并分次转移至5ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密吸取0.5ml,加入内标溶液B 0.5ml,混匀,离心5分钟(每分钟10000转),取上清液作为总肽供试品溶液。照校正因子测定项下方法,自“精密吸取10μl,精密加入硼酸盐缓冲液70μl”起,依法测定,按内标法以峰面积计算各氨基酸的含量。
本品每ml含总肽以门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸的总量计不得少于0.23mg。