照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱Agilent Zorbax SB-C18 250mm×4.6mm,5μm);以乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱(出峰完毕后用高比例的乙腈冲洗色谱柱);检测波长为327nm。理论板数按绿原酸计算应不低于20000。
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) | 流速(ml/min) |
0~20 | 5→10 | 95→90 | 0.8 |
20~30 | 10 | 90 | 0.8 |
30~45 | 10→18 | 90→82 | 0.8→0.5 |
45~55 | 18→23 | 82→77 | 0.5 |
55~70 | 23 | 77 | 0.5 |
对照品溶液的制备 取咖啡酸对照品、绿原酸对照品和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品适量,精密称定,分别加含2.5%甲酸的50%甲醇溶液制成每1ml含咖啡酸2μg、含绿原酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸各5μg的混合溶液,即得。
供试品溶液的制备 精密量取本品5ml,置10ml量瓶中,加5%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。以绿原酸对照品为参照,以其相应的峰为S1峰,计算新绿原酸、隐绿原酸的相对保留时间;以4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品为参照,以其相应的峰为S2峰,计算3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%范围内。相对保留时间及校正因子见下表:
待测成分(峰) | 相对保留时间 | 校正因子 | 参照峰 |
新绿原酸 | 0.64 | 1.00 | S1 |
绿原酸 | 1.00 | 1.00 | S1 |
隐绿原酸 | 1.07 | 1.01 | S1 |
3,4-二咖啡酰奎宁酸 | 0.91 | 1.48 | S2 |
3,5-二咖啡酰奎宁酸 | 0.95 | 0.95 | S2 |
4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸 | 1.00 | 1.00 | S2 |
以绿原酸的峰面积为对照,分别乘以校正因子,计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量;以4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的峰面积为对照,分别乘以校正因子,计算3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的含量。
本品每1ml含金银花、栀子以新绿原酸(C16H18O9)、绿原酸(C16H18O9)、隐绿原酸(C16H18O9)、咖啡酸(C9H8O4)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(C25H24O12)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(C25H24O12)和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸(C25H24O12)的总量计,应为32 ~130μg。