谭德讲副主任等2人赴德国参加2023药学实验室大会

二、会议内容

2023Pharmalab-Congress共设1个主会场和5个分会场，各分会的报告内容主要介绍①分析实验室GMP法规趋势、②分析方法的生命周期管理、③内毒素与热原检测方法、④微生物快速和替代检测方法、⑤细胞和基因治疗等领域的最新进展。谭德讲副主任、贺庆研究员主要参加了内毒素和热原检测方法分会，会议报告主要内容如下：

Dr GwenaelCirefice (EDQM)介绍了欧洲药典(EP)朝不基于使用动物的热原检测方法发展的最新进展：基于风险分析EP未来将主要采用LAL/rFC BET、MAT来控制产品的内毒素/热原，同时将形成新的热原章节（EP 5.1.13），计划到2026年EP将彻底淘汰RPT（EP 2.6.8）；EP采取的上述热原检测策略已得到全球的重视和积极响应，但在全球范围内推行该策略将会是一个长期过程，同时强调国际监管协调的重要性。基于使用经验和反馈，MAT(EP 2.6.30)修订内容包括将采用试验灵敏度代替LOD，计算样品MVD；内毒素标准曲线可使用非线性回归模型，同时删除平行性的要求；将MAT的方法A（定量法）与方法B（半定量法）合并形成方法1，方法1中的内毒素回收浓度调整为内毒素标准曲线中点或近中点浓度，方法1对溶液B和C不规定特定的稀释系数，可在审查产品特异性验证的数据后选择稀释系数；在成功鉴定并符合EP 2.6.30对检测内毒素和非内毒的相应要求后，可使用其他细胞系；修订后的EP 2.6.30将于2024年1月出版、2024年7月执行。针对含有固有热原成分而无法排除干扰作用的疫苗，通过与参考批次进行一致性评价(reference lot comparison test)而非安全性评价方法。EP将建立新的章节(EP 2.6.40 monocyte-activationtest for vaccines containing inherently pyrogenic components)以促进MAT(EP 2.6.30)中方法C的执行，该章节也将于2024年1月出版、2024年7月执行。

Dr. Jelena Novakovic Jovanovic(Galenika)介绍EP中内毒素检测法概况（包括LAL 2.6.14/rFc 2.6.32 BET）；在复合基质人疫苗的内毒素检测中，LAL与重组因子C(rFc)法具有可比性（Comparison of LAL and recombinant Factor C endotoxin testing assays in human vaccines with complex matrices. PDAJ PHARM SCI TECH. 2020-01-01;74(4):394-407.）。Dr Ana Gonzalez Hernandez (GSK)介绍采用rFc BET评价不同药学等级水中内毒素的适用性和比较研究：采用rFc BET减少和替代LAL BET是GSK 2030可持续发展目标的一部分；通过与动态显色（KCA）、动态浊度(KTA)法LAL BET进行比较研究，回收率结果显示用于评价不同药学等级水时，rFc BET与其具有可比性，同时rFc BET也适用于评价GSK的相关产品；未来进一步加速rFc BET的替代应用则面临全球监管协调的挑战。Dr Holger Kühn (BioChem)介绍其建立rFc BET用于评价相关产品内毒素的研究过程：通过比较不同rFc BET试剂盒的技术参数(如检测步骤的复杂性、与现有仪器设备的兼容性、费用和有效期等)，采用水进行内毒素加样回收率实验评价所选rFc BET的方法适用性，进一步采用其评价复杂基质样品（如人/牛白蛋白、具有极端pH值的缓冲液、胎牛血清、重金属盐、抗生素），回收率结果结果显示rFc可用于评价上述样品的内毒素。

Dr Hiroki Fukuchi (FUJIFILM)介绍一种新型重组鲎试剂(rCR)产品的开发过程，基于鲎试剂检测内毒素原理，该rCR含有重组C因子、重组B因子、凝固酶原和显色底物，其不会与β-glucan产生交叉反应，具有更好的内毒素特异性；通过方法验证[包括线性、精密度(重复性、中间精密度)、定量范围和检测限]，并通过与LAL BET进行比较研究，结果表明该rCR与LAL具有等效性。Dr Jordi Iglesias (Charles River)介绍其开发的一种重组鲎试剂( rCR/rLAL)产品，通过将不同灵敏度等级的rLAL与动态显色法(KCA) LAL进行比较，不同样品的应用结果相关性分析表明rCR与KCA LAL具有等效性。

Dr Veronika Wills (Associates ofCape Cod)介绍内毒素检测方法的变革发展，传统LAL试剂已被各国药典BET采用，其存在较大的批间差异，与β-glucans存在交叉反应，来源于鲎血；重组试剂(如rFc、rCR)具有较好批间一致性，不与β-glucans存在交叉反应，为非动物源性试剂，但其目前尚未被各国药典广泛采纳、且未经国际监管协调；USP、EP和日本药典均已或将采纳重组试剂(rFc和rCR)用于内毒素检测法。

Dr Josephine Hubloher (PEI)介绍非内毒素参考品的研制情况，热原是一类化学结构多样性的物质，包括微生物(如病毒、真菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等)和非微生物(如环境颗粒等)来源性热原，细菌内毒素仅为革兰氏阴性菌来源的一种热原物质，随着体外热原检测技术(如MAT)发展，为了更好控制产品安全，提出了研制非内毒素热原参考品的需要；理想的非内毒素参考品应具有较好安全性、可及性、稳定性和MAT反应活性，目前初步选取了不同TLRs配体[如LTA、MALP-2、FSL-1、Pam₂CSK₄、Pam₃CSK₄、FLA-ST、FLA-BS、R848]，评价并比较其在不同MATs中的反应活性，下一步将进一步评价其稳定性。

Dr Kasia Marciniak-Darmochwal(CRL)介绍其开发的一种新型MAT方法，该方法利用永生化单核细胞系(aMylc)作为反应模型，利用IL-6作为检测指标，具有灵敏度高、稳定性好等特点。

三、会议体会

通过此次会议，我们深入了解到非动物源性体外热原/内毒素检测技术及其相关产品正在国际上经历快速发展，使用非动物源性体外热原/内毒素检测技术控制产品质量是该领域发展的未来主流趋势。一方面，已有非动物源性体外热原/内毒素检测技术（MAT、rFc BET）正被进一步应用于解决复杂产品的质量控制问题，同时正向自动化方向深度发展，基于使用经验和反馈，其方法学也在不断调整优化；另一方面，面对上述新技术应用中存在的问题（如MAT所用的血细胞来源不便），研究人员也在不断开发和升级新型检测方法（如aMylc/IL-6、rCR BET），我院在该方向已取得一定进展，通过创新反应模型和检测指标，国际率先建立报告基因热原检测法及其药典标准，后续应积极了解并紧跟国际发展趋势，不断创新，推动体外热原/内毒素检测技术的进一步发展。