【检查】(1)照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验 :以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(资生堂CAPCELL ADME C18色谱柱,柱长为625px,内径为4.6mm,粒径为5μm);以乙腈-0.05%氨水(10 : 90)为流动相,流速0.6ml/min;检测波长为283nm;柱温为30℃
对照品溶液的制备:分别精密称取2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、5-羟甲基糠醛和糠醛对照品适量,加水制成每1ml含20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取供试品5g,精密称定,置烧杯中,精密加水20ml,称定重量,超声处理(功率:500W,频率:40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用水补足减失的重量,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl,注入液相色谱仪,测定,即得。
液相如检出则采用高效液相色谱法-质谱联用方法验证。
(2)照液相-质谱法(中国药典2015年版四部通则0512和通则0431)测定
色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(资生堂C18色谱柱,柱长为375px,内径为2mm,粒径为3μm);以乙腈-5mM乙酸铵(10 : 90)为流动相;柱温为30℃,流速为0.2ml/min。
质谱条件:以三重四级杆串联质谱仪检测;电喷雾离子源(ESI),使用正离子扫描模式;监测模式为多反应监测(MRM),5-羟甲基糠醛参考保留时间、监测离子对、碰撞电压(CE)见表1.
表15-羟甲基糠醛的保留时间、监测离子对、碰撞电压与检出限参考值
保留时间(min) | 母离子 | 子离子 | CE(V) | |
5-羟甲基糠醛 | 3.8 | 126.60 | 109.00 | 14 |
126.60 | 81.00 | 20 |
对照品溶液的制备:取5-羟甲基糠醛对照品适量,精密称定,加水制成每1ml含10μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取(1)项下供试品溶液,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1µl,注入液质联用仪,测定,即得。
结果判断:比较对照品溶液及供试品溶液的质谱及相对丰度比,以确证供试品中是否检出5-羟甲基糠醛。参考国标GH/T 18796-2012蜂蜜标准,拟定5-羟甲基糠醛的限度为不得过40mg/kg。