注射用核糖核酸Ⅱ检验方法(2):注射用核糖核酸Ⅱ中活力测定的检验方法

发布时间:2017-06-20

活力测定(白细胞吸附抑制实验)

供试品溶液的制备取减压干燥至恒重的供试品适量,按含量测定结果计算供试品中核酸含量,用Hanks液将供试品溶解并稀释制成每1ml中含10 mg的溶液,作为供试品溶液。

小鼠脾细胞悬液的制备采集新鲜健康小鼠脾,置Hanks液中,研磨并经200目不锈钢网过滤,收集滤液,以每分钟1000转离心5分钟,弃上清。沉淀物中加预冷红细胞崩解液约5ml,置37℃水浴中10分钟使红细胞裂解,以每分钟1000转离心5分钟,弃上清,收集细胞沉淀,用Hanks液清洗2遍,再用Hanks液制备成每1ml约含4×107个细胞的脾细胞悬液。

测定法在96孔细胞培养板中进行,供试品孔与对照孔各做4孔,供试品孔每孔加供试品溶液50μl,对照孔中加入同体积Hanks 液,然后每孔中加入小鼠脾细胞悬液50μl,将培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育。2小时后取出培养板,在水平振荡仪上以每分钟100转振摇2分钟,将未粘附细胞摇起,吸出上清液。每孔再加入Hanks液50μl,按上法洗一次,将洗液与上清液合并(勿起气泡)。在405nm处测每孔的吸光度,作为供试品与对照粘附后细胞吸光度值。另取供试品溶液50μl,加Hanks液50μl与小鼠脾细胞悬液50μl,混匀,在405nm处测每孔的吸光度,作为供试品粘附前细胞吸光度值。另用Hanks 液50μl代替供试品溶液50μl,同法测定,作为对照粘附前细胞的吸光度值。按下式计算供试品粘附抑制率:供试品的粘附抑制率不得少于20%。

粘附率= 粘附前细胞的吸光度值—粘附后细胞的吸光度值×100%

      粘附前细胞的吸光度值

粘附抑制率= 对照粘附率—供试品粘附率 ×100%
            对照粘附率

粘附前供试品与对照在405nm处的吸光度值不得低于0.4,粘附后吸光度值不得低于0.1,对照粘附率不得低于40%,各个复孔吸光度值相对标准偏差(RSD)不得过15%,结果可判为有效;否则应重新测定。

备注:Hanks 液取磷酸氢二钾 0.06g,氯化钠 8.0g,碳酸氢钠 0.35g,氯化钾 0.4g,无水葡萄糖1.0g,磷酸氢二钠0.14g,无水氯化钙 0.14g,硫酸镁 0.1g,氯化镁0.1g,加去离子水 900ml溶解,用盐酸调节pH值至6.5,用去离子水稀释至1000ml,0.22µm滤膜除菌过滤后4℃保存一个月,临用前用5.6%碳酸氢钠溶液调节pH 值至7.2~7.4。

红细胞崩解液取三羟甲基氨基甲烷1.03g,氯化铵3.735g,加去离子水400ml溶解,用盐酸调节pH值至7.2,用去离子水稀释至500ml,在115℃高压灭菌15分钟后4℃保存一个月。