【鉴别】穿山甲片粉碎，过6号筛。称取粉末10 mg，加8 M尿素1 ml，再加1 M的二硫苏糖醇（DTT）10 μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30 μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml， 加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%NH4HCO3溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）20 μl，摇匀，37℃恒温酶解16h以上，作为供试品溶液。另取穿山甲对照药材粉末（过6号筛）10 mg，同法制成对照药材溶液。

照高效液相色谱-质谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径为2.1mm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4 ml。

采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI⁺），进行多反应监测（MRM），选择质荷比（m/z）615.3（双电荷）→832.3和（m/z）615.3（双电荷）→775.3作为检测离子对。取穿山甲对照药材溶液，进样5μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。

吸取供试品溶液5μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。以质荷比（m/z）615.3（双电荷）→832.3和（m/z）615.3（双电荷）→775.3离子对提取的供试品离子流色谱中，应同时呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。

【检查】

大穿山甲成分 照高效液相色谱法和质谱法测定

色谱、质谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径为2.1mm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4 ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI⁺），进行多反应监测（MRM），选择质荷比（m/z）435.2（双电荷）→ 539.3和（m/z）435.2（双电荷）→ 482.2作为检测离子对。取大穿山甲成分参比溶液，进样5μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。

大穿山甲成分参比溶液的制备 取大穿山甲工作对照药材粉末，过6号筛。称取粉末10 mg，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇（DTT）10μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml，摇匀，取溶液500μl置10ml量瓶中，加中华穿山甲基质溶液（取中华穿山甲对照药材粉末，过6号筛。称取粉末10mg，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇（DTT）10μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml，摇匀，即得）稀释至刻度，加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%NH4HCO3溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）20μl，摇匀，37℃恒温酶解16h，即得。

供试品溶液的制备 取样品粉碎，过6号筛。称取粉末10 mg，加8 M尿素1 ml，再加1 M的二硫苏糖醇（DTT）10 μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30 μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml， 加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%NH4HCO3溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）20 μl，摇匀，37℃恒温酶解16h以上，作为供试品溶液。

测定法 分别吸取大穿山甲成分参比溶液和供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。

结果判断 以质荷比（m/z）435.2（双电荷）→ 539.3和（m/z）435.2（双电荷）→ 482.2离子对提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与大穿山甲成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中（m/z）435.2（双电荷）→ 539.3的色谱峰面积应不得大于参比溶液中相应的峰面积值。

树穿山甲成分 照高效液相色谱法和质谱法测定

色谱、质谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径为2.1mm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4 ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI⁺），进行多反应监测（MRM），选择质荷比（m/z）451.5（四电荷）→540.6和（m/z）451.5（四电荷）→ 564.0作为检测离子对。取树穿山甲成分参比溶液，进样5μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。

树穿山甲成分参比溶液的制备取树穿山甲工作对照药材粉末，过6号筛。称取粉末10 mg，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇（DTT）10μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml，摇匀，取溶液500μl置10ml量瓶中，加中华穿山甲基质溶液（取中华穿山甲对照药材粉末，过6号筛。称取粉末10mg，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇（DTT）10μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml，摇匀，即得）稀释至刻度，加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%NH4HCO3溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）20μl，摇匀，37℃恒温酶解16h，即得。

供试品溶液的制备 取样品粉碎，过6号筛。称取粉末10 mg，加8 M尿素1 ml，再加1 M的二硫苏糖醇（DTT）10 μl，水浴60℃加热30 min，放冷，加入1M的碘乙酰胺（IAA）30 μl，黑暗静置30min，加1% NH4HCO3溶液稀释至10ml， 加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%NH4HCO3溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）20 μl，摇匀，37℃恒温酶解16h以上，作为供试品溶液。

测定法 分别吸取树穿山甲成分参比溶液和供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。

结果判断 以质荷比（m/z）451.5（四电荷）→540.6和（m/z）451.5（四电荷）→ 564.0离子对提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与树穿山甲成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中（m/z）451.5（四电荷）→540.6的色谱峰面积应不得大于参比溶液中相应的峰面积值。